Ламинат westerhof отзывы: Ламинат Westerhof (Вестерхоф) – отзывы покупателей и история компании

Ламинат Westerhof (Вестерхоф) – отзывы покупателей и история компании

Итоговый рейтинг

5 51 12345

В чем преимущества и особенности ламината Westerhof? Отзывы реальных покупателей и мнение профессионалов. История о возникновении и история компании.

Напольное покрытие под маркой Westerhof – традиционный продукт многонационального качества. Для его производства применяют немецкие технологии, японское оборудование, китайские площади и европейский контроль. Несмотря на некоторую принадлежность к азиатскому происхождению, специалисты оценивают ламинат как достойный конкуренции с известными брендами. Разберем подробнее.

Нюансы производства Westerhof

Стоит сказать, что Китай – это территория производства ламината даже именитых брендов. Компании, таким образом, удешевляют собственное производство, ввиду того что в Поднебесной дешева рабочая сила и электричество. Это первый нюанс. Далее:

  • Оборудование для производства ламината постоянно совершенствуется, и процесс становится практически полностью автоматизированным. Это позволяет экономить на персонале, но при этом улучшать технические характеристики ламината. Например, его стабильность в течение всего срока эксплуатации.
  • Постоянный мониторинг спроса на продукцию. Оцениваются все критерии – декор, размерный ряд, толщина покрытия и даже стоимость. Составляются графики продаж по сегментам и странам, и бизнес процветает благодаря грамотному распределению ресурсов и готового продукта.
  • Производство ламината, несмотря на сегмент-эконом, не приемлет попустительства в сертифицировании продукта. Немецкие технологии этого требуют. Westerhof отмечен декларациями экологии – EPD, «Голубой Ангел» и прочие. Управление брендом отмечено как эффективное – ISO.

Итак, Westerhof как бренд ни чем не уступает остальным производителям ламината. У них также можно найти соответствующую сертификацию, а особенности производства сообразны возможностям компаний.

Плюсы ламината Westerhof

У ламината этого бренда преимущества аналогичны другим производителям, но есть и особенности:

  • Стойкость к абразивному истиранию. Это происходит благодаря высокому классу – 33 и достаточному верхнему защитному слою.
  • Устойчивость к нагрузкам, давлению и любым бытовым реалиям. Ламинат для жизни предполагает инертность к царапинам, пятнам, подвижкам мебели, ударам и деформациям.
  • Инертность к выцветанию. Многие варианты эконом-класса не могут похвастать своими досками, способными выгорать от длительного взаимодействия с УФ-лучами. Если в комнате разложены ковры, это особенно видно. Westerhof лишен такого дефекта.
  • Гигиеничность поверхности объясняется неспособностью ламината впитывать бытовые загрязнения. Кроме этого, ламинат антистатичный, гипоалергенный, имеет знак борьбы с астматическими реакциями.

После укладки и во время эксплуатации, выявятся и другие преимущества – сохранение тепла и препятствие выходу или проникновению звуков. Эксплуатация Westerhof доставит удовольствие владельцам пола.

Основные линейки бренда таковы:

• Маэстро. Музыкальное название предполагает творческий подход. Половицы отличаются буйством красок, нестандартных решений. В коллекции собраны 4 группы досок с поэтичными названиями, подходящие теме линейки – либретто, соната, ариозо, сюита. У коллекции прекрасные характеристики – высокая износоустойчивость, выдерживание бытовых и коммерческих нагрузок.

• Аристократ. Половицы с достоверностью передают вид настоящей паркетной доски, уложенной в художественную композицию. Позволить себе натуральный массив ручной работы – могут не все. Ламинат же данной коллекции доступен каждому, и лишь специалист найдет разницу с природным сырьем.

• Селебрити. Согласно названию, половицы оцениваются специалистами как трендовые. С ними легко создать современный интерьер с имитацией натурального пола. Этому еще более способствует фаска. Поверхность полуматовая, абсолютно гладкая, но при этом нескользящая – ламинат остается безопасным для всех домочадцев.

• Винтаж. Натуральные полы, состаренные временем – это тренд. У бренда эта коллекция определенно подойдет под стиль усадьбы или деревенского рынка. Поверхность имеет эффект скобления, тон светлый, выбеленный. Половицы универсальны – подойдут для дома или коммерческих помещений.

Выбирайте и наслаждайтесь эффектной поверхностью.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

отзывы о производителе ламината Вестерхоф, страна, 34 класс

Европейское качество, надежность и долговечность – это главные особенности продукции бренда немецкого ламинита Вестерхоф. В Европе Германия является страной-производителем высококачественных продуктов. Уже много лет ламинат этой компании держит лидерские позиции на рынке строительных материалов. Бренд Westerhof гарантирует качество, созданное по последним немецким технологиям и разработкам лучших мастеров страны. Не смотря на то, что производственные мощности компании расположены за пределами государства, это не мешает ей оставаться одним из лидеров ниши стройматериалов в Европе.

Что такое ламинат Вестерхоф (Westerhof)

Ламинатом принято называть напольное покрытие, в основе которого находится очень плотно спрессованная древесноволокнистая плита, покрытая декоративным слоем. Ламинат – продукт многослойный, его база защищена всевозможными пропитками и смолами, которые накладываются друг на друга, создавая слоистость. Верхний слой ламината играет и декоративную, и защитную роли, препятствуя его от механическим и химическим повреждениям, а также скорому изнашиванию.

Состав ламината: из чего изготавливают ламинатное покрытие?

Ламинат вестерхоф выигрышно выделяется из сотен других предложений потому, что он:

  • выполнен из экологически чистых материалов;
  • обладает прекрасными износостойкими характеристиками;
  • наделен роскошным внешним видом.

Какая подложка под ламинат лучше?

Все эти характеристики объединены под именем торговой марки в дополнение которых можно добавить и неизменное с годами высокое качество.

Ламинат бренда одинаково хорошо подходит для использования в жилых, производственных и офисных помещениях, а также на торговых площадках, выставочных центрах и помещениях сферы гостинично-ресторанного хозяйства.

Вестерхоф производит свои ламинированные полы только из современных материалов, предварительно протестированных на прочность и безопасность. Передовые технологии дали возможность компании создать максимальное удобство в процессе укладки, оснастив ламинат бесклеевым замком click-to-click, который позволяет собрать напольное покрытие как пазл, без проблем и наличия профессиональных навыков. Что касается прочности и надежности, то ламинату Westerhof нет равных. Любой ламинат делят по классам прочности.

Ламинат вестерхоф обладает характеристиками очень высокой прочности, и представлен в классах от 31 до 34, в зависимости от способностей выдерживать конкретный вес.

Главными преимуществами напольного ламинированного покрытия Westerhof являются:

  • высокая устойчивость к износу;
  • плотное покрытие каждой доски акриловой смолой для защиты от стирания;
  • стойкость к химическим повреждениям и высоким температурам;
  • великолепная переносимость перестановки мебели, каблуков и падений тяжелых предметов.

Разновидности и характеристики

Ламинат Вестерхоф представлен 32, 33 и 34-м классами прочности, каждый из которых включает в себя определенные коллекции. Выбор подходящего ламинита нужно осуществлять исходя из необходимых:

  • цветовой гаммы;
  • материалов из которых изготовлен;
  • ширины досок;
  • узора покрытия.

Пробковая подложка под ламинат: особенности укладки. 

Коллекции 32 класса

В структуре класса можно найти такие основные коллекции:

  • Classik – коллекция их 10 видов плиток, узор которых повторяет натуральную структуру дерева. Этот ламинат идеален для жилого помещения, он способен выдержать механическое воздействие и влагу. Он хорошо будет смотреться и в классическом интерьере, и в более современных дизайнах.
  • Novelty – коллекция недорогого напольного покрытия, которое имитирует структура дерева и подходит для укладки в любом помещении. В этой коллекции представлены широкие доски и разнообразная цветовая гамма, начиная от белого, заканчивая густым коричневым цветом.
  • Smart – коллекция с матовым покрытием досок, имитирующим дерево каштана и дуба. Сделает любой интерьер роскошным и дорогим.

Для производства ламината, который относится к 32-ому классу прочности используется плита донган, покрытая специальной мид-пленкой, толщина каждой доски достигает 8 мм.

Коллекции 33 класса: Aristocrat (Аристократ), Vintage, Celebrity

В этом классе представлены коллекции, ламинат которых обладает сверхпрочностью и устойчивостью к любым повреждениям. Толщина доски достигает 12 мм, ламинат собирается как пазл, благодаря системе single click. Доски этого напольного покрытия обладают очень четким, почти как натуральным, узором под дерево и обширной цветовой гаммой.

Как рассчитать ламинат для комнаты в квартиру?

В линейку класса 33 входят коллекции:

  • Vintage – классический вариант доски, которая предназначается для укладки в офисных помещениях. Ламинат этой линии наделен хорошей износостойкостью, что придаст офисному напольному покрытию долговечный «товарный вид».
  • Celebrity –ламинат, разработанный дизайнерами специально для внесения изюминки в помещения ресторанов, кафе, баров и ночных клубов. Благодаря сверхпрочности, он способен выдержать большие потоки людей.
  • Country – доска, обладающая стереосинхронезированным верхним шаром и высокой прочностью. Узор, который изображен на ламинате, практически не отличим от натуральной древесины. Он идеально подходит для напольных покрытий загородных домов или квартир.
  • Shine – ламинат, с характерным рисунком узором «под дерево». Подходит для квартиры. В верхний слой ламината входят компоненты, которые наделяют его блеском, отсюда и его название.
  • Aristocrat – отличается от других коллекций интересным дизайном узоров: различных ромбов, квадратов и переплетений. Подходит для кладки в больших залах, театрах, в выставочных павильонах.
  • Mario Loretto -ламинат, который относится к категории недорогих, обладает высокой прочностью и износостойкостью. Оснащен надежной системой замка ARC Cliск.

Коллекции 34 класса: Maestro Super Step

Этот класс наделен самыми прочными, влаго-, тепло-, водостойкими параметрами, в его основе лежит плотная HDF плита, с ювелирной точностью выполненная под натуральное дерево. Станет идеальным напольным покрытием для помещений с большой нагрузкой, например в торговых сетях, в коридорах и кабинетах различных учреждений. Коллекция, которая представляет этот класс, носит название Maestro Super Step.

Что такое подложка под ламинат?

Выбирая ламинат той или иной коллекции, обращайте внимание на эксплуатационные характеристики и предназначенность для конкретного помещения.

Небольшой обозревательный курс по укладке ламината

О производителе

Немецкая компания-производитель и по совместительству популярный европейский бренд Westerhof занимает одну из лидирующих позиций на рынке стройматериалов в нише ламинированных напольных покрытий. Придуман, разработан и развит бренд был известными производственными мастерами европейского уровня, талантливыми дизайнерами и грамотными управленцами. Компания базируется в Германии, а производственные мощности размещены в основном в Китае. С 2010 года производство ламината открыто и на территории России.

Ценовая политика и способы покупки

Цены на ламинат

Бренд позиционируется на рынке как гарант качества, надежности и эстетичного вида. Качество, как правило, синоним высокой цены, но в случае с брендом Вестерхоф качество – это доступная цена. Политика компании в сфере ценообразования построена таким образом, чтобы потенциальный клиент мог приобрести понравившийся и подходящий его целями ламинат по доступной и адекватной цене. Таким образом, компания стремится расширить количество лояльных клиентов, которые поймут, что качественным может быть не только очень дорогой товар.

Цены на ламинат Вестерхоф нельзя назвать низкими, но и завышенными тоже, он прочно обосновался в среднем ценовом сегменте.

Каждый вид ламината, из каждой коллекции и класса имеет свою цену, которая зависит от эксплуатационных характеристик и места предназначения к укладке.

Как купить

Приобрести ламинат этого бренда можно в большинстве интернет-магазинов, специализирующихся на продаже продукции строительной сферы. Интернет-магазин для покупки удобен тем, что там можно подробно изучить предложения, просмотреть каталоги, сравнить цены. Так, купить ламинат можно и на рынке, и в гипермаркете стройматериалов, на складе компании-производителя. Удобство этого способа покупки состоит в том, что вы можете наглядно оценить фактуру, цветовую гамму, размеры плит и т.д.

Отзывы пользователей

Большинство покупателей действительно отмечают высокое качество продукта. У них не вызывает сомнений то, что ламинат, изготовленный на немецком оборудовании, не может разочаровать. Также клиенты отмечают тот факт, что ламинат вестерхоф очень просто укладывается, на вид определяют, то что материал, из которого изготовлены доски действительно роскошный. Спустя некоторое время, пока он пребывает в эксплуатации, появляются доказательства его надежности, стойкости к вытиранию и другим повреждениям. Негативные отзывы проявляются в том, что некоторые покупатели отметили крошение краев досок при укладке.

При выборе конкретного вида ламината, отзывы владельцев ламинированного пола доской вестерхоф играют немаловажную роль.

Советы по выбору

Процесс выбора ламината должен происходить с учетом следующих моментов:

  • определитесь с цветовой гаммой, узором ламината;
  • выбирайте ламинат, который будет подходить под стиль интерьера;
  • обратите внимание на края досок, они должны быть цельными и не крошиться;
  • если выбираете ламинат в комнату, не останавливайте свой выбор на слишком светлом или очень темном цвете, иначе пол будет постоянно бросаться в глаза;
  • старайтесь мониторить отзывы на ламинат в пользу которого вы хотите сделать выбор, возможно вы найдете проявление характеристик, которые для вас просто неприемлемы;
  • обратите внимание на то, чтобы все доски были без царапин, пятен.

Теплый пол под плитку: какой лучше и как правильно класть.

Многофункциональный и несложный дизайн узкой комнаты читайте тут.

Дизайн частного двора: https://trendsdesign.ru/dachi/chastnyj-dvor/dizajn-chastnogo-dvora.html

Выводы

Ламинат Вестерхоф – это качетсво, надежность и долговечность. В его ассортименте каждый индивидуальный покупатель и строительная компания смогут отыскать идеальный для себя продукт. Обладая высокой стойкостью к разного рода действиям внешних факторов, он надолго сохраняет товарный вид.

Прочный материал, эстетичный внешний вид, безупречная имитация натуральной древесины, широкая цветовая гамма и адаптация под любое помещение – вот что делает продукт вестерхоф востребованным не только среди европейских потребителей, а и во всем мире. Приемлемые цены позволяют компании осуществлять большие обороты, а покупателям – приобретать отличное напольное покрытие, которое легко содержать в чистоте, которое не требует кропотливого ухода.

Также пользователей интересует ламинат maxwood и ламинат brilliant.

классы и материалы, цвета и отзывы 2021

Ламинированные полы сочетают в себе надежность, качество и практичность. Каждый, кто заходит в дом, обратит внимание на красивый пол. К выбору покрытия на пол необходимо подходить ответственно. Хороший вариант – ламинат Westerhof, о преимуществах и недостатках которого расскажем в данной статье.

Особенности

Ламинат изготавливается из трех и более слоев различных материалов, которые соединяются под высоким давлением. Высокие эксплуатационные характеристики достигаются благодаря современной технологии производства. Основой покрытия является древесноволокнистая доска, декорированная специальным слоем.

Для защиты основания от влаги оно покрывается меламиновой смолой, а наружная поверхность покрывается защитной пленкой. Возможно использование дополнительных слоев.

Качественный ламинат способен заменить такой материал, как паркет. Он имеет множество достоинств и недостатков в сравнении с другими напольными покрытиями.

Ламинат марки Westerhof обладает безупречным качеством и отличается «многонациональным» производством. Его производят по немецким технологиям на японском оборудовании, которое находится в Китае. Изделие проходит европейский контроль качества. На территории Китая производят не только ламинат компании Westerhof, но и другие товары знаменитых брендов. Производство изделий удешевляется, за счет того, что в Китае дешевая рабочая сила и недорогое электричество.

Оборудование, на котором производится ламинат Westerhof, постоянно совершенствуется, а технологический процесс полностью автоматизирован. Данный факт дает возможность сэкономить на персонале. Свойства и характеристики изделия при этом улучшаются.

Специалисты компании постоянно проводят мониторинг спроса на свою продукцию. Проводят оценку качества, внешнего вида, габаритных размеров и толщины покрытия.

Достоинства

Благодаря высоким технологическим свойствам и строению напольное ламинированное покрытие практично, эстетично и долговечно при условии соблюдения эксплуатационных правил.

Изделие обладает такими качествами, как:

  • Повышенная выносливость к абразивному истиранию. Ламинат, который имеет 33-й или 34-й класс обладает прочным защитным верхним слоем.
  • Устойчивость к применяемым нагрузкам, постоянному или периодическому давлению и другим бытовым повреждениям. Изделие противостоит царапинам, передвижке мебели, деформации и сильным ударам.
  • Противостояние к выцветанию под воздействием ультрафиолетовых лучей.
  • Хорошие свойства влагостойкости и устойчивость к загрязнениям.
  • Повышенная антистатичность и гипоаллергенность.
  • Хорошие характеристики теплопроводности.
  • Высокая звукоизоляция.
  • Поверхность, имитирующая фактуру натурального дерева.
  • Состав из экологичных материалов позволяет использовать ламинат в любом помещении.
  • Высокая термостойкость покрытия.
  • Верхний слой изделия устойчив к химическим растворам, маслам, кислотам и щелочной бытовой химии.
  • Материал не чувствителен к появлению пятен, в том числе от лака, шариковой ручки и фломастера, легко моется.
  • Быстрая установка.

При производстве ламината Westerhof используют только качественные материалы и современные технологические процессы. Все операции и конечная продукция проходит тщательный контроль качества. Изделия занимают лидирующие позиции на строительном рынке. Благодаря высокой прочности при соединении каждого элемента, достигается и высокое качество.

Продукция изготавливается в современном дизайне и большой цветовой палитре. В современных коллекциях сочетаются натуральные древесные материалы во всех исполнениях по цвету и фактуре. Продукция имеет высокую износостойкость.

Коллекции

Основными линейками бренда являются:

  • Серия Maestro. Толщина доски 12 миллиметров. Изделия изготавливаются в разнообразных экзотических расцветках. Коллекция обладает хорошими характеристиками и свойствами: износоустойчивость, не подвергается бытовым нагрузкам, оригинальный внешний вид.
  • Серия Aristokrat. Наружная поверхность напольного покрытия схожа с паркетной доской. Это самая доступная и оригинальная коллекция, с помощью нее создается красивый и неповторимый интерьер.
  • Коллекция Celebrity. Половицы из этой серии считаются трендовыми. При помощи их создается стильный и современный интерьер с имитацией натурального напольного покрытия. Поверхность изделия гладкая, полуматовая и не скользящая. Фаска, расположенная по краю изделия, защищает его от пыли и грязи.
  • Винтажная коллекция (Vintage) подходит для деревенского стиля. Натуральное покрытие, состаренное временем или искусственно, имеет скобленную светлую поверхность. Изделие подходит для жилого дома и офисного помещения.

Марка Westerhof предлагает разнообразные оттенки, фактуры и стили. Половицы с имитацией натуральной древесины подходят для каждого интерьера. Если сочетать несколько досок разных оттенков и фасками с четырех сторон, то получается эффект пола из натурального дерева.

Разделение покрытий по классам

Ламинат, как покрытие, разделяется на классы, согласно прочностным характеристикам, противостоянию к повреждению и выгоранию, а также предназначению. Чем выше класс продукции, тем длительней срок эксплуатации. Изделие марки Westerhof изготавливается в трех классах: 32, 33 и 34.

32 класс

Продукция средней износостойкости имеет 32-й класс. Укладывается в жилых или в промышленных помещениях, где проходимость среднего уровня. В жилом доме, чаще всего ламинат 32 класса монтируется в кухне, прихожей или столовой, где он прослужит около 15 лет. К публичным помещениям относят школы и офисы, срок службы изделия в них до 5 лет.

К 32 классу относятся такие коллекции, как:

  • Style classic – имитирующая древесину.
  • Style smart – схожа с изделиями из натурального дерева.
  • Style novelty – выполнена в популярных оттенках.

33 класс

Изделия 33 класса производятся из древесноволокнистой плиты, имеющей высокую плотность. Поверхность оснащена бесклеевым замковым соединением, обработанным воском, который предотвращает попадание воды.

Изделие укладывается в комнатах с большой посещаемостью: офисах, барах, ресторанах и гостиницах.

Коллекции с 33 классом покрытия:

  • Mаestro Innovаtion – древесные оттенки.
  • Mаestrо Aristоcrаt – широкие панели, похожие на паркетную доску, изготовленные из дорогих пород древесины и декорированные камнем.
  • Mаеstrо vintаgе – древесный рельефный узор.
  • Mаestro shine – светлое покрытие, подходящее для современных стилей.
  • Mаrio loretto – выполнена в теплых оттенках с оригинальным тиснением структуры.

34 класс

Ламинат с 34 классом обладает высокими прочностными характеристиками и долговечностью. Он эксплуатируется во всех помещениях. Доски стыкуются замком V-Click, панели обработаны воском.

Коллекции, изготавливаемые с 34-м классом качества:

  • Mаestro lounge – ламинат широкого формата, схожий с натуральным камнем.
  • Mаеstro grаnd stylе – фактурный древесный дизайн.
  • Mаеstrо wооd line – панели в разнообразных теплых оттенках.
  • Mаestro super step – изготавливается технологией глубинного тиснения, с натуральной древесной структурой.

Слои ламинированного изделия:

  • Верхний слой предназначен для декорации и защиты от повреждений. Он прочный и устойчивый к влиянию окружающей среды. Наружная поверхность покрыта меламиновой смолой со стабилизирующими добавками.
  • Наружный декоративный слой состоит из бумажной основы с нанесенным рисунком. Основа изготавливается из древесноволокнистой плиты, которая придает основные технические характеристики изделию. Стабилизирующий слой из парафиновой бумаги необходим для защиты от влаги.

Технология монтажа

Ламинат монтируют «плавающим» методом. Такая технология подразумевает соединение двух панелей, не касаясь основания пола. Замки с торцов панелей защелкиваются друг с другом.

Производимая продукция обладает разными системами замков: Arc Click, Big Singl Click и Strong Special Click.

Благодаря высокому качеству замков пол смотрится монолитным. Укладка ламината проста, что является одним из его достоинств. Многие отзывы подтверждают, что с монтажом может справиться даже неопытный работник.

Для успешного завершения работы необходимо соблюдать технические требования:

  • Подготовьте поверхность, где будет укладываться ламинат. Ровное, высушенное и чистое основание – залог качественного напольного покрытия, которое прослужит долгое время. Необходимо обязательно устранить все недостатки.
  • Чаще всего полы в помещении цементные, поверх которых укладывают гидроизоляционную пленку для защиты от влаги. После пленки используют специальную подложку, которая сглаживает все неровности на полу, а также избавляет от посторонних звуков при ходьбе.
  • Классические или широкоформатные панели укладывают с сохранением необходимого зазора по всей длине. Это дает возможность покрытию увеличиваться при изменении влажности и окружающей температуры в помещении.

Существует много способов укладки ламината: можно монтировать ламели диагонально или по прямой, елочкой или в половину доски.

Перед приобретением строительного материала, необходимо правильно рассчитать количество покрытия. Не стоит забывать об отходах, которых в среднем бывает 10% от общего количества материала. Если укладывать покрытие по диагонали, то этот показатель достигает 15%.

В процессе эксплуатации ламинированная плитка деформируется, чтобы этого не произошло, не используйте для основания текстильные материалы. Поверхность должна быть твердой и ровной. Каждая маленькая неровность скроется под подложкой, которая также будет дополнительной шумоизоляцией. Самым подходящим материалом для нее является пробка.

Монтаж ламината на влажный пол не производится. Недавно залитый цементный пол необходимо просушить около 80 дней. Влажность в помещении должна быть примерно 30-60%. Под подложку укладывают паронепроницаемый и влагонепроницаемый материал.

Если укладывать ламинированное покрытие на систему теплых полов, то требуется придерживаться некоторых правил:

  • Черновой пол и система подогрева должны быть на расстоянии 30 миллиметров друг от друга.
  • Деформационные швы должны отставать от стены на 12 миллиметров.
  • Перед тем как укладывать ламинат на пол, система подогрева должна работать не меньше трех недель. Все работы проводятся в хорошо проветриваемом помещении с низким уровнем влажности.

Более подробно об укладке ламината смотрите в следующем видео.

описание коллекций и отзывы покупателей

Выбирая напольное покрытие для своей квартиры всегда предпочтительней ориентироваться на бренды, а затем уже обращать внимание на дизайн. Однако, ламинат westerhof maestro shine сразу бросается в глаза и подкупает элегантностью и натуральностью поверхности.

Продукция торговой марки westerhof выпускается в разных странах, в том числе и России. Экологическая безопасность и выполнение санитарных требований обеспечиваются благодаря высокотехнологичному производству и соблюдению высоких стандартов европейского качества.

Ламинированные полы

Ламинат – это материал, состоящий из нескольких слоев, которые соединены под действием высокого давления. Его свойства обусловлены технологией производства. Основу напольного покрытия составляет доска из ДВП, на которую нанесен декоративный слой.

Чтобы защитить основу от губительного влияния влаги, с нижней стороны она покрывается меламиновой смолой, а сверху полимерной защитной пленкой. Изготовитель не раскрывает всех тонкостей производства и может использовать дополнительные слои.

Такая структура делает напольное покрытие из ламината практичным, красивым и долговечным (при соблюдении правил эксплуатации). Ему свойственны такие качества:

  • легкость укладки;
  • сопротивление сжатию при нагрузке;
  • устойчивость к выгоранию от солнечных лучей;
  • стойкость к истиранию;
  • простой уход, возможность использования бытовой химии;
  • термостойкость;
  • антистатичность;
  • возможность размещения системы теплого пола.

Укладка ламината производится методом «плавающего пола», когда покрытие не крепится к основанию, а панели соединяются только между собой. Крепление их друг к другу происходит путем защелкивания замков, расположенных на торцах. Система замков может быть различной.

Так, ламинат westerhof mario loretto оснащен системой Arc Click, maestro aristocrat имеет замок Big Singl Click, в коллекции super step используются покрытые воском замки Strong Special Click. Несмотря на небольшие отличия, различные модели ламината westerhof отличаются неизменно высоким качеством стыковки. Такой пол выглядит как монолитный.

Дизайн напольного покрытия

Маркой westerhof представлены не только различные оттенки. Поражает разнообразие фактур и стилей. Имитация натурального дерева (super step и другие) подойдет для интерьера в любом стиле.

Для классических дворцовых стилей можно выбрать благородные модели maestro aristocrat или lounge в виде паркета из ценных пород дерева или натурального камня. Коллекция innovation с отчетливым рисунком с трещинками будет уместен в сельском дизайне.

Совет! Для больших жилых или коммерческих помещений лучше всего подойдет широкоформатный ламинат (lounge или aristocrat). Изучив отзывы, можно сказать, что его укладка производится просто и удобно. Такие модели, как например super step, выглядят более привычно.

Благодаря сочетанию досок разного оттенка, особенно имеющих четырехстороннюю фаску, можно добиться эффекта натурального покрытия из древесины редких пород. Причем по функциональности ламинат превосходит оригинал, а цена намного приятней. Способы укладки покрытия могут быть разными: вдоль помещения, поперек или по диагонали.

Стыки панелей, например super step, расположенных вдоль направления дневного света, менее заметны, уложенный таким образом ламинат кажется монолитным. Поперечное расположение досок поможет визуально сделать пол шире. Диагональное расположение покрытия эффективно маскирует непропорциональность комнаты или ее неправильную форму.

Модели ламината Westerhof

Ламинированное напольное покрытие разделяют на классы в зависимости от прочности, устойчивости к истиранию и назначения. Чем больше число, характеризующее класс, тем дольше прослужит покрытие. Марка westerhof представлена 32, 33 и 34 классом. 32 класс характеризуется средней износостойкостью.

Он используется как в жилых, так и коммерческих помещений со средним уровнем проходимости. Для квартир это кухня, прихожая, столовая. Может применяться в школах, офисах и т.д. Прослужит в жилом помещении 12-15 лет, в офисе – 3-5 лет. Представлен такими коллекциями:

  • style classic – с натуральной расцветкой под дерево в 10 различных декорах;
  • style smart – имитирует различные породы древесины, благодаря использованию немецкой бумаги в декоративном слое;
  • style novelty – кроме разных оттенков дуба имеет цвет венге и секвойа.

В 33 классе используется ДВП более высокой плотности. Бесклеевые замки имеют обработку воском, что создает барьер для попадания влаги. Такое покрытие подходит для помещений с высокой проходимостью: офисов, баров, ресторанов, гостиниц и т.д.:

  • maestro innovation – натуралистичный дизайн древесины разных оттенков;
  • maestro aristocrat – состоит из широкоформатных панелей, имитирующих наборной паркет из ценных пород дерева с инкрустацией из камня;
  • maestro vintage – модные оттенки древесины с рельефным узором, имитирующим брашированные доски;
  • ламинат westerhof maestro shine – прекрасное решение для светлых интерьеров, создает современный свежий дизайн;
  • mario loretto – подборка теплых естественных оттенков со структурным тиснением.

Ламинат 34 класса отличается повышенной прочностью и долговечностью. Он может быть использован в любых помещениях. Стыковка происходит с помощью замов V-Click с обработкой стыков воском для защиты от влаги. Покрытие подходит для помещений большого размера, особенно широкоформатные панели:

  • maestro lounge – уникальная коллекция широкоформатного ламината, имитирующего натуральный камень;
  • maestro grand style – широкоформатные панели с натуральным фактурным древесным дизайном;
  • maestro wood line – теплый натуральный декор разных оттенков;
  • maestro super step – при изготовлении используется глубинное тиснение, точно передающее натуральную структуру древесины.

Совет! Чтобы помещение казалось более просторным, лучше выбирать напольное покрытие светлых оттенков. Хорошо подойдет расцветка Дуб Мафф из коллекции maestro super step или Романтик из maestro aristocrat.

Особенности укладки покрытия

Главным преимуществом ламината можно считать простоту укладки. Даже непрофессиональный мастер справится с этой задачей быстро и без затруднений, о чем говорят многочисленные отзывы. Главное условие успешной работы – соблюдение технологических требований:

  • Правильная подготовка. Основание должно быть ровным (с отклонением не более 2 мм на метр), сухим и чистым. Все недостатки пола должны быть устранены в обязательном порядке.
  • На цементный пол должен быть уложен слой гидроизолирующей пленки, которая защитит покрытие от влаги.
  • Обязательным условием является использование подложки, которая не только поможет сгладить неровности пола, но и избавит от шума при ходьбе.
  • При укладке панелей, как обычных (например, maestro super step) или широкоформатных (maestro aristocrat), требуется оставлять технологический зазор по всему периметру пола, который позволит покрытию свободно расширяться при изменении влажности и температуры.

Ламинат westerhof относится к высококачественным напольным покрытиям, отзывы о которых всегда положительные. Популярные модели, в частности maestro aristocrat и super step, не только прекрасно смотрятся в интерьере, но и легко укладываются. Широкая гамма цветов удовлетворит самого взыскательного заказчика.

Westerhof ламинат

Немецкий ламинат от производителя Westerhof, как сообщает официальный сайт компании, российский потребитель покупает с 2010 года. Появление бренда Westerhof стало следствием совместной работы европейских производителей и российских дизайнеров. Коллекции торговой марки Westerhof производятся в нескольких странах, их активно покупает клиент и за пределами РФ. Ламинат от производителя Westerhof, легко купить во многих магазинах и интернет-магазинах, производится по европейским технологиям. Строго соблюдаются экологические нормы и требования к качеству продукции. Производство оборудовано высокотехнологичными автоматизированными линиями. За счет экономии времени, снижается цена без потери качества продукции. Поэтому ламинат Westerhof можно купить относительно дешево, по сравнению с конкурентными аналогами. В основе ламелей высокопрочная HDF-плита, плотность которой составляет 900 г/кв. м.

Дизайнерские решения

В коллекциях ламината Westerhof, фото которого легко найти в сети Интернет, представлены образцы 33 и 34 класса износостойкости. Фактически это покрытия для коммерческого использования, которое широко применяется в жилых помещениях. Их покупает поклонник красоты, комфорта. Каждая серия продукции отличается современным дизайном, разнообразием цветов, текстур и оттенков. Заказать возможно любую. Рассмотрим несколько популярных коллекций ламинатного покрытия Westerhof, представленных в разделе каталог официального сайта производителя. Фото и цена — на сайте.

  • Westerhof Maestro Aristocrat. Отличается изысканным аристократическим дизайном. Состоит из широкоформатных панелей, предназначенных для укладки в больших помещениях. Декоры покрытия достаточно амбициозны и позволяют воплощать самые креативные идеи. Благодаря большому размеру (120х40 см), ламели быстро и легко монтируются. Толщина доски 12 миллиметров. Вы можете посмотреть фото изделия на официальном сайте, купить у нас.
  • Style Grand. Отличительная черта этой коллекции – благородная цветовая гамма и натуральная текстура внешнего слоя. Доски этой серии часто покупает любитель прованса, натуральности в интерьере. Ламели устойчивы к высоким температурам, влаге, воздействию ультрафиолета и средств бытовой химии. По периметру каждая доска оснащена специальной фаской, которая делает стыки незаметными. Размеры плиты 121,5х19,7 см, толщина 8 мм. В нашем интернет-магазине можно заказать модель этой линейки. 
  • Super Step. Коллекция выполнена в оттенках натурального дуба. Поверхность тисненная. Замки обработаны воском, что существенно упрощает процесс монтажа. Специальная V-образная фаска делает места стыков практически незаметными. Толщина ламели 12 мм, а размер 121,5х24 сантиметров. Ее покупает ценитель роскоши и уюта. 
  • Wood Line. Текстура натурального дерева гармонично сочетается с современными графическими узорами. Ламинат этой серии прост в монтаже и уходе, поэтому его часто покупает молодая семья, чтобы не тратить лишнего времени на уборку. Толщина материала 12 миллиметров, размер плиты 121,5х19,6 сантиметров. Вы можете ознакомиться с фото и ценой на сайте, там же и купить.  

Где купить ламинат?

В каталоге нашей компании Вы можете заказать ламинатные покрытия и другие материалы для ремонта и обустройства дома от ведущих российских и зарубежных производителей. Материалы просто сравнивать между собой и выбрать то, что больше всего подходит Вам по цене и дизайну. Благодаря тесным партнерским отношениям с производителями, цена всегда выгодна.

Укладка ламината, паркетной доски и пробки в Москве, МО

Расценки          Контакты           Отзывы        [ Добавить новость ]

Укладка ламината, паркетной доски, замкового пробкового покрытия, монтаж плинтуса в Москве и МО.

Частный мастер Александр по укладке ламината    т. 8-926-226-01-90, т. 8-915-024-58-33.

Здравствуйте! Рад Вас приветствовать на моём сайте.

Зовут меня Александром. С 2000 года (20 лет) укладка паркетной доски, укладка ламината, укладка пробкового покрытия, а также монтаж плинтусов и установка порогов моя спецификация.

- Я занимаюсь только полами (монтаж ламината, монтаж паркетной доски, а также монтаж пробкового полаустановка пластиковых плинтусов, монтаж порогов в Москве и МО).

- Я считаю, что профессионально можно заниматься чем-то одним, а не быть универсалом, как многие другие мастера. (Мне часто приходится укладывать ламинат, паркетную доску или пробковый ламинат заново, исправляя недочёты других мастеров, работающих непрофессионально).

Не редко заказчик отдаёт предпочтение фирмам, которые обещают быстро и качественно с гарантией выполнить работы по укладке паркетной доски, ламината, пробки и т.д.. На самом деле это только обещание. Я долгое время работал на фирмах и не понаслышке знаю о беспорядках существующих там. Во первых профессионалы якобы работающие у них, постоянно меняются, обучение происходит во время работы. (А через несколько дней самостоятельно на объект).  Инструменты, которые берут в аренду у фирмы постоянно разные и зачастую неисправные или не по назначению. Во вторых по поводу гарантий: Нередко со слезами приходится доказывать свою правоту и всё без результата. Мало кто решает судиться.

- Опыт приобретённый за эти годы позволяет мне быстро и качественно на профессиональном уровне выполнять работы по настилу пола. (Как правило уложить  ламинат или уложить паркетную доску в свободной от мебели комнате до 30 кв. м. занимает от 3-5 часов).

 С 2000 года моё основное занятие - настил ламината, настил паркетной доски, укладка замковой пробки. За долгие годы работы я приобрёл высокую профессиональную квалификацию. Кроме практических знаний технологий, прекрасно ориентируюсь в марках ламината, паркетной доски, замковой пробки, знаю профессиональные тонкости и секреты, которые помогают сэкономить материалы для  обустройства ламинированного пола , нисколько не ухудшая при этом качества напольного покрытия  экономя тем самым Ваши деньги и время.

В последнее время появилось много новых материалов, таких как замковой кожаный пол (Качественное покрытие из спрессованных волокон кожи под высоким давлением - натуральный продукт), виниловый ламинат (Влагостойкое  ламинированное покрытие, которое можно применять на кухне, в санузла и т.д.).

- Я использую современные и профессиональные инструменты, необходимые  укладки ламината и крепления плинтуса. Смотри раздел «Инструменты»

- Я работаю без выходных дней в Москве и МО (Московской области).

- Наличие автомобиля даёт возможность добраться до объекта быстро.

Цены на работы (укладка паркетной доски цена за м2 (кв. метр , квадрат), укладка ламината цена за м2 (кв. метр , квадрат),  укладка пробкового покрытия цена за м2 (кв. метр , квадрат),  установка пластиковых плинтусов цена, монтаж порогов цена) можно увидеть, перейдя на страницу «Расценки»

Стоимость укладки ламината, стоимость укладки паркетной доской и прочих покрытий для пола сильно зависит от объёма работы (площади помещения). Чем больше площадь комнаты, в которой происходит укладка ламината, цена за м2  существенно уменьшается.

Расценки на укладку ламината, укладку пробки или укладку паркетной доски зависят от способа укладки. Укладка ламината по прямой намного проще, чем укладка ламината по диагонали. Поэтому и цена на укладку по диагонали выше, чем цена на укладку ламината по прямой. В отличии от ламината, паркетная доска укладка которой тяжелее цена не может быть ниже.

Стоимость настила подложки под ламинат включена  в прайс монтажа ламината.

Цена на настил пробки, паркетной доски или ламината, также сильно зависит от опыта и профессионализма мастера выполняемого требуемую работу. Приезжие мастера, с низкими профессиональными навыками, работают по более низким расценкам. Качество работы намного хуже, зачастую неприемлемое, требующее переделки и покупки испорченного материала заново.

 На Московских рынках (Синдика О, Концевой-2, Мытищинская ярмарка, Каширский двор, Владимирский тракт, Тракт-Терминал, Мельница, Суперстрой, Коренфор, Дмитровский двор и т.д.) и в магазинах (гипермаркеты ОБИ, Лёра-Марлен, Наш дом, Станок Хоттабыч и т.д.) сейчас очень много различных материалов для обустройства ламинированных полов, отличающихся и ценами и качеством. За последнее время многие рынки закрылись временно на реконструкцию или навсегда. Многие закупают ламинированный паркет, паркетную доску, плинтус, подложку и т.д. в интернет-магазинах, не выходя из дома по очень привлекательным ценам.

Для правильного выбора материалов обращайтесь ко мне «Контакты» постараюсь Вам помочь, Александр.

Можно самостоятельно выполнить укладку ламината, своими руками. Если Вы сами решили выполнить укладку ламината, самостоятельно подобрать нужные материалы попробуйте обратиться к странице «Помощь в работе».

Если Вы хотите оставить предложения или отзывы о выполненных  мною работах прошу перейти на страницу  «Отзывы» в Гостевой книге.

Положить ламинат, положить пробковое покрытие, положить паркетную доску, вроде дело несложное, но если Вы никогда не занимались укладкой пола, советую Вам обратиться к профессионалу.

Звоните с 8:00 - 24:00 без выходных.

Укладка ламината, паркетной доски, замковой пробки недорого, быстро и качественно.

Оптимизация микрожидкостных каналов для улучшения гидродинамической диссоциации клеточных агрегатов и тканей

Abstract

Максимизация скорости и эффективности, с которой отдельные клетки могут высвобождаться из тканей, значительно продвинула бы диагностику и терапию на основе клеток. Обычные методы включают в себя многочисленные этапы ручной обработки и длительное время ферментативного переваривания, но по-прежнему неэффективны. В предыдущей работе мы разработали микрофлюидное устройство с сетью разветвляющихся каналов для улучшения диссоциации клеточных агрегатов на отдельные клетки.Однако это устройство не тестировалось на образцах тканей, и дальнейшее развитие было ограничено высокой стоимостью и низким разрешением функций. В этой работе мы использовали однослойную полиимидную пленку, подвергнутую лазерной микрообработке, в качестве инструмента быстрого прототипирования, чтобы оптимизировать конструкцию наших микрофлюидных каналов и максимизировать эффективность диссоциации. Это привело к новому дизайну с меньшими размерами и геометрией акульего плавника, что увеличило извлечение отдельных клеток из агрегатов раковых клеток. Затем мы протестировали характеристики устройства на ткани почек мыши и обнаружили, что оптимальные результаты были получены при использовании двух последовательно соединенных микрофлюидных устройств, за которым следовала большая оригинальная конструкция, за которой следовала новая конструкция акульего плавника в качестве заключительного этапа полировки.Мы предполагаем, что наши микрофлюидные устройства для диссоциации будут использоваться в исследованиях и клинических условиях для создания отдельных клеток из различных образцов тканей для диагностических и терапевтических целей.

Введение

Недавние исследования важности клеточной неоднородности и редких клеток-драйверов в сочетании с достижениями в области секвенирования и технологий молекулярного обнаружения помогли открыть эру диагностики отдельных клеток 1 - 5 Это привело к амбициозным усилиям, таким как инициатива Human Cell Atlas по идентификации и характеристике типов клеток в организме 6 , 7 , а также потенциальному использованию функциональной информации отдельных клеток для диагностики и лечения заболеваний 5 , 8 - 13 .Однако большинство клеток находится в тканевых массах и органах, и, таким образом, необходимы значительные усилия для диссоциации передней части ткани до анализа отдельных клеток 2 . Современные процедуры диссоциации тканей включают измельчение тканей на мелкие кусочки с помощью скальпеля, длительное переваривание протеолитическими ферментами и механическую обработку пипетированием и / или встряхиванием. Это трудоемкий, трудоемкий и неэффективный процесс, который часто приводит к неполному извлечению всех отдельных клеток из данного образца ткани.В частности, длительное время переваривания может привести к плохому качеству клеток из-за изменений в профилях молекулярной экспрессии и / или гибели. Таким образом, улучшение диссоциации тканей таким образом, чтобы отдельные клетки могли быть высвобождены быстрым, щадящим и тщательным образом, резко расширило бы клинический потенциал диагностики отдельных клеток с помощью таких методов, как проточная цитометрия, масс-спектроскопия и секвенирование отдельных клеток 1 , 2 , 14 , 15 . Области тканевой инженерии и регенеративной медицины также напрямую выиграют от улучшения получения здоровых и функциональных первичных, предшественников и стволовых клеток из различных органов и тканей для использования в тканевых конструкциях и терапии на основе клеток 16 - 22 .

Микрожидкостные устройства были разработаны для помощи диссоциации, при этом ранние работы были сосредоточены на переваривании, разрезании или физическом разрушении тканей или клеточных агрегатов 23 - 25 . Однако эти устройства либо не были специально разработаны для производства отдельных ячеек, либо страдали от серьезных проблем с засорением. В предыдущей работе мы разработали новое микрофлюидное устройство для быстрого и эффективного постепенного разрушения клеточных агрегатов на отдельные клетки 26 .Ключевые особенности включали в себя множество разветвленных каналов, размер которых уменьшился с миллиметров до сотен микрон, а также повторяющиеся расширения и сужения ширины канала, которые генерировали гидродинамические струи жидкости. В результате к агрегатам и кластерам ячеек прикладывались напряжения сдвига разного масштаба и величины для механического отделения ячеек друг от друга. Обширные испытания агрегатов и сфероидов раковых клеток показали, что наше микрофлюидное устройство значительно улучшило восстановление клеток с точки зрения количества и чистоты отдельных клеток.Эти результаты были получены при минимальном протеолитическом расщеплении, а в некоторых случаях даже без использования ферментов. Более того, мы не наблюдали изменений жизнеспособности клеток, а общее время обработки составило менее 10 минут. Однако до настоящего времени мы не тестировали это устройство на реальных образцах тканей, которые все равно потребовали бы измельчения вне чипа и переваривания перед механической диссоциацией. Кроме того, мы изготовили наши устройства из нескольких слоев твердого пластика, используя коммерческий процесс изготовления ламината.Хотя это обеспечило надежное устройство, которое можно было производить в крупных масштабах, дальнейшая разработка устройства была ограничена высокой стоимостью изготовления и плохим разрешением коммерческих лазеров. Таким образом, необходим метод быстрого прототипирования для оптимизации конструкции микрожидкостных каналов и улучшения характеристик диссоциации.

В быстром прототипировании микрофлюидных устройств доминируют фотолитография и формование полидиметилсилоксана (PDMS), потому что это быстро, недорого, просто в использовании и имеет относительно высокое разрешение.Однако эластичная природа PDMS является недостатком для приложений, которые требуют высоких потоков жидкости или давления 27 , таких как диссоциация тканей. Более того, методы изготовления с использованием шаблонного формования не идеальны для многослойных устройств или крупномасштабного производства. Полимерные пленки, подвергнутые лазерной микромеханической обработке, в сочетании с клейкими лентами для переноса для склеивания в последнее время стали надежным и экономичным методом быстрого прототипирования для микрофлюидных устройств 28 .Универсальность и эффективность таких устройств была продемонстрирована на множестве микрофлюидных приложений с разрешением каналов порядка 50 мкм 29 - 35 . Наиболее важно то, что использование полимерных пленок, подвергнутых лазерной микромеханической обработке, и клейких лент для переноса данных будет повторять форму и функции коммерческих ламинатных систем, используемых для нашего оригинального устройства микрофлюидной диссоциации.

В этой работе мы используем полиимидные пленки, подвергнутые лазерной микрообработке, в качестве инструмента быстрого прототипирования для оптимизации конструкции нашего устройства для диссоциации агрегатов микрожидкостных клеток.Сначала мы демонстрируем, что устройство на основе однослойной полиимидной пленки может диссоциировать агрегаты раковых клеток на отдельные клетки, но не так эффективно, как многослойные аналоги. Однако уменьшение размеров канала улучшает производительность, так что эффективность диссоциации сравнима с нашим многослойным устройством и даже превосходит его. Затем мы используем моделирование вычислительной гидродинамики для оптимизации конструкции расширения каналов, в результате чего получаем новую геометрию, которую мы называем плавником акулы. В то время как конструкция акульего плавника незначительно улучшает диссоциацию агрегатов раковых клеток, увеличение степени расширения канала акульего плавника дает лучшие результаты диссоциации, которые мы видели на сегодняшний день.Наконец, мы проверяем производительность наших микрофлюидных устройств диссоциации с использованием ткани почек мыши. После стандартных процедур измельчения тканей и переваривания коллагеназы мы обнаружили, что микрофлюидная обработка резко увеличивает восстановление отдельных клеток, снижает количество агрегатов и поддерживает жизнеспособность клеток. Наилучшие результаты достигаются при использовании двух последовательно соединенных микрожидкостных устройств, при этом оригинальное многослойное устройство сначала сокращает крупные фрагменты и агрегаты тканей на более мелкие единицы, а затем следует заключительный этап полировки образца с использованием нового оптимизированного устройства однослойного плавника акулы для получения большего количества отдельных клеток.По сравнению со стандартным методом ферментативного расщепления в течение 1 часа, обработка с двумя устройствами дает в три раза больше отдельных клеток за то же время переваривания и сопоставимые количества после всего лишь короткого 15-минутного переваривания. Эта работа впервые устанавливает, что микрофлюидная диссоциация увеличивает скорость и эффективность производства единичных клеток из переваренной ткани. Более того, при работе с тканью необходимо сочетание различных устройств и принципов работы, чтобы охватить достаточно большой диапазон размеров каналов и поперечных сил.В будущих исследованиях мы продолжим изучение новых конструкций устройств для диссоциации, а также их интеграцию с другими микрожидкостными операциями, чтобы обеспечить дальнейшую обработку и анализ клеток. Мы также изучим производительность с использованием различных типов тканей, включая различные нормальные органы и образцы солидных опухолей.

Результаты и обсуждение

Конструкция устройства

Наша первоначальная конструкция устройства микрожидкостной диссоциации состояла из сети разветвляющихся каналов, ширина которых постепенно уменьшалась, и каналы были расположены на трех слоях жесткого полиэтилентерефталата, разделенных сквозными слоями 26 .Каналы также содержали повторяющиеся расширения и сужения, которые генерировали струи жидкости для создания силы сдвига, необходимой для отделения ячеек друг от друга. В этой работе мы использовали полиимидные пленки, подвергнутые лазерной микрообработке, и клейкие ленты для переноса в качестве метода быстрого прототипирования, чтобы оптимизировать как ширину канала, так и форму расширения канала для улучшения характеристик диссоциации. Устройства были изготовлены из четырех слоев полимерных пленок / листов, каждый из которых был скреплен липкой лентой для переноса (рис.). Элементы микрожидкостных каналов были подвергнуты лазерной микрообработке в полиимидные пленки, что обеспечило гораздо более высокое разрешение элементов, чем было достигнуто в многослойном устройстве (см. Дополнительную информацию, рис. S 1 ). Мы также исследовали новые конструкции каналов, такие как уменьшение минимальной ширины канала с первоначального значения 125 мкм на последней стадии до 100 и 75 мкм. Размеры канала в пределах ступени 5 показаны для всех трех конструкций в дополнительной информации, рис. S 2 ).Обратите внимание, что все коэффициенты масштабирования каналов были сохранены из исходной конструкции устройства, включая минимальную ширину канала между различными ступенями ответвления (коэффициент 2) и расширение до ширины сужения внутри каждой ступени (коэффициент 3). Основываясь на моделировании вычислительной гидродинамики (CFD), уменьшение ширины канала до 100 и 75 мкм увеличит максимальную скорость потока внутри сужений канала на 15 и 65% соответственно (рис.). Поскольку сдвиг жидкости масштабируется как с увеличением скорости, так и с уменьшением размеров канала, он увеличится на 50 и 150% соответственно.Мы также рассчитали скорость сдвига на осевой линии, возникающую из-за градиентов потока в осевом и поперечном размерах, и результаты показаны на рис. Уменьшение ширины канала до 100 и 75 мкм увеличило максимальную скорость сдвига на 90 и 350% соответственно. Интересно, что скорость сдвига была самой высокой при переходе от расширения к сжатию, поскольку жидкость ускорялась до максимального значения. Также присутствовали две дополнительные области умеренной скорости сдвига, которые соответствовали отдельным стадиям замедления флюида в областях расширения и сжатия.Основываясь на этих наблюдениях, мы предположили, что диссоциация клеточных агрегатов может быть усилена путем объединения двух меньших пиков скорости сдвига от замедления в один, больший пик. Поэтому мы исследовали новые конструкции областей расширения с помощью моделирования CFD и определили несимметричную геометрию, характеризующуюся более постепенным начальным расширением с последующим более резким сужением, которое мы назвали акульим плавником (рис.). Конструкция акульего плавника не изменила значения максимальной скорости потока или скорости сдвига, поскольку они были продиктованы минимальной шириной канала, обнаруженной в месте сужения.Однако акульий плавник увеличил величину пика скорости сдвига в области расширения на 50% (рис.). Следует отметить, что второй пик торможения в области перетяжки пропал. Наконец, мы также создали удлиненный акульий плавник (ESF), удвоив наклон конструкции сужения акульего плавника (рис.), Что дополнительно увеличило скорость сдвига при входе в область расширения (рис.). Таким образом, конструкции акульего плавника и ESF обеспечивали две области с высокой скоростью сдвига по сравнению с одной большой и двумя областями с умеренной скоростью сдвига для исходного устройства.Размеры канала в пределах ступени 5 показаны для конструкций акульего плавника и ESF в дополнительной информации, рис. S2. Изображения однослойных устройств диссоциации полиимида с оригинальной и удлиненной конструкцией каналов акульего плавника показаны на рис.

Однослойное микрофлюидное устройство на основе полиимида с новой конструкцией каналов. ( a ) Изображение в разобранном виде, показывающее четыре слоя устройства, включая, сверху вниз, верхний акриловый слой, выходной слой ПЭТ, канальный слой, полученный лазерным травлением полиимидной пленки, и нижний слой ПЭТ.Клейкие ленты для переноса приклеивали к слоям ПЭТ и использовали для скрепления устройства. Отверстия, используемые для крепления шланговых заусенцев, показаны в верхнем слое. ( b ) Моделирование гидродинамики методом конечных элементов, показывающее профили скорости для (i) исходного, (ii) акульего плавника и (iii) удлиненного акульего плавника (сверху вниз) с минимальной шириной 125, 100 и 75 мкм. . Моделирование проводилось со скоростью 1 мл / мин. Уменьшение ширины канала привело к более высоким максимальным скоростям потока в сужениях канала, в то время как удлиненный акульий плавник обеспечил больший разброс скорости потока между расширениями и сужениями.( c ) Скорость сдвига по средней линии устройства для оригинальной конструкции при разной ширине канала. Можно увидеть три пика скорости сдвига, каждый из которых увеличивается с уменьшением ширины. Главный пик соответствует ускорению жидкости между расширениями и сужениями, а два меньших пика обусловлены замедлением жидкости в отдельных областях. ( d ) Конструкции «акульего плавника» и ESF увеличивают скорость сдвига из-за замедления жидкости при расширении, но больше нет второго пика внутри сужений.( e ) Фотографии изготовленных однослойных устройств с оригинальным (слева) и удлиненным (справа) акульим плавником. Оба устройства имели минимальную ширину канала 100 мкм на пятой ступени.

Оценка устройств одноканального уровня с разной шириной канала

Сначала мы сравнили производительность оригинальной конструкции канала в новом однослойном устройстве с исходной многослойной версией. Для этих исследований мы использовали монослои линии клеток рака молочной железы человека MCF7, которые являются сильно связанными и производят большое количество агрегатов после рутинного культивирования клеток и трипсинизации.Как и в предыдущей работе, клетки суспендировали в буфере и вводили в микрофлюидные устройства с помощью шприцевого насоса со скоростью 12,5 мл / мин и пропускали через устройство 3 или 10 раз. Сточные воды устройства собирали, и количество ячеек определяли количественно с использованием счетчика ячеек. Для многослойного устройства не наблюдалось никаких изменений в восстановлении клеток после 3 проходов, но 10 проходов генерировали на 20% больше клеток (рис.). Однослойное устройство не показало значительного изменения количества ячеек ни в одном случае. Таким образом, упрощение конструкции до одноканального слоя существенно снижает диссоциативную способность.Скорее всего, это было связано с тем, что образцы больше не смешивались путем изменения направления при переходе от одного каскада к другому, и ячейки больше не проходили через переходные отверстия, которые эффективно действуют как двумерные сужения. Затем мы исследовали эффект уменьшения размеров каналов по всему устройству таким образом, чтобы минимальная ширина на последних этапах составляла 100 и минимальная ширина 75 мкм. Результаты устройства 100 мкм были аналогичны исходному многослойному устройству после 3 и 10 проходов. Уменьшение ширины канала до 75 мкм обеспечило наибольшее количество ячеек после прохождения через устройство 3 и 10 устройств, что более чем удвоило количество новых одиночных ячеек, генерируемых по сравнению с исходным многослойным устройством.Хотя результаты отдельных клеток обычно были связаны с высокой вариабельностью, мы отмечаем, что способствующим фактором была проблема воспроизводимого создания аналогичных исходных совокупных популяций от эксперимента к эксперименту.

Оценка однослойных устройств при разной ширине канала. ( a ) Клетки рака молочной железы MCF7, выделенные в сточных водах устройства, были количественно определены и нормализованы по исходному значению до обработки устройства. Первоначальное многослойное (ML) устройство значительно улучшило выход отдельных ячеек после 10 проходов, но этого не наблюдалось в однослойном (SL) устройстве с теми же размерами канала (125 мкм).Однако уменьшение ширины канала улучшило производительность, при этом устройство SL с шириной 75 мкм превосходит корпус ML. (b ) Микрофотографии, показывающие суспензии клеток (i) до обработки устройства и (ii-iv) после 10-кратного прохождения через (ii) устройства ML, (iii) SL 125 и (iv) SL 75. Масштабная линейка 100 мкм. ( c ) Гистограмма площади единицы ячейки, определенная путем анализа микрофотографий, что приводит к классификации отдельных ячеек (<80 пикселей 2 и соотношение сторон <1,2), кластеров (от 80 до 200 пикселей 2 и форматного соотношения> 1.2; 2–3 ячейки), мелкие агрегаты (от 200 до 300 пикселей 2 , 4–10 ячеек) и большие агрегаты (> 300 пикселей 2 ,> 10 ячеек). Данные были объединены между 3 и 10 условиями прохождения. ( d ) Популяции клеток, представленные выше, в виде общих процентов для контроля, устройства ML и различных устройств SL после 10 проходов. Обработка устройства устранила почти все крупные агрегаты и большинство мелких агрегатов, что привело к более высокой чистоте отдельных ячеек. Кластеры лишь немного уменьшились. Планки погрешностей представляют собой стандартные ошибки по крайней мере из трех независимых экспериментов.* означает p <0,05 относительно контроля, не обработанного устройством (значение = 1).

Чтобы получить информацию об агрегированных популяциях, суспензии клеток были визуализированы в фазовом контрасте до и после обработки устройством (рис.). Затем были обработаны микрофотографии для идентификации смежных клеточных единиц и определения их площади. Результаты представлены в виде гистограммы на рис. Контрольная и обработанная устройством популяции MCF7 были похожи до ~ 200 пикселей 2 , или 750 мкм 2 , и с этого момента в контроле было значительно больше событий.После обширных перекрестных ссылок с исходными микрофотографиями мы определили четыре категории популяции: отдельные клетки, кластеры (от 2 до 3 клеток), небольшие агрегаты (от ~ 4 до 10 клеток) и большие агрегаты (> 10 клеток). Эти категории были определены в первую очередь на основе значений площади, однако мы наблюдали перекрытие между популяциями отдельных ячеек и кластеров, и поэтому включили соотношение сторон в качестве вторичного показателя. Количество событий в каждой категории было суммировано для каждого условия лечения, и результаты представлены для условий 10-проходного устройства на рис.. Единичные клетки составляли менее половины от общего числа событий для контроля, но увеличивались до ~ 70% при обработке устройством. На малые и большие агрегаты приходилось примерно 10% событий в элементах управления. Обработка устройств уменьшила количество мелких агрегатов примерно наполовину и крупных агрегатов до <1% для корпусов устройств. Первоначально кластеры составляли 35% контрольных групп, а для всех устройств они сократились примерно до 25%. Аналогичные результаты наблюдались после 3 проходов (см. Дополнительную информацию, рис.S3), но с несколько более высоким процентом кластеров и агрегатов.

Оптимизация геометрии канала

Затем мы исследовали влияние формы канала, а именно нового акульего плавника и расширенной геометрии расширения акульего плавника. Снова были проведены эксперименты с использованием агрегированной модели рака MCF7. Первоначальная конструкция была снова протестирована для прямого сравнения и в целом дала аналогичные результаты для ширины обоих каналов (рис.). Конструкция «акульего плавника» была немного лучше оригинальной при минимальной ширине 100 мкм, но не было никакой разницы в характеристиках при минимальной ширине 75 мкм.Удлиненный плавник акулы был наиболее многообещающим, с повышенным количеством клеток по всем измерениям и числам проходов, а также с самым высоким общим уровнем произведенных одиночных клеток. Хотя тенденции были очевидны, следует отметить, что различия между условиями устройства не были статистически значимыми из-за различий между экспериментами. Как обсуждалось ранее, эту изменчивость можно частично объяснить различиями в исходных совокупных популяциях. Мы дополнительно количественно оценили кластеры и агрегаты ячеек на микрофотографиях, а гистограммы площади ячеек показаны в дополнительной информации на рис.S4. Для всех условий устройства почти все крупные агрегаты и большинство мелких агрегатов были диссоциированы, в то время как небольшие кластеры оставались в диапазоне 40–45%. Процент отдельных клеток был повышен с 35 до ~ 50% для большинства случаев. Удлиненный акульий плавник с минимальной шириной 75 мкм обеспечил оптимальные результаты с самым высоким процентом одиночных клеток (60%) и самым низким процентом всех совокупных видов.

Оптимизация геометрии канала. ( a ) Нормализованное количество клеток MCF7, полученное для однослойных устройств с исходной геометрией канала «акульий плавник» и «удлиненный акульий плавник» (расширенный SF) с минимальной шириной канала 100 и 75 мкм.Все устройства производили больше одиночных клеток после 10 проходов, но только акульий плавник и расширенный SF были значительными. ( b ) Популяции клеток нанесены на график как общий процент для контроля и различных устройств SL после 10 проходов. Расширенная конструкция SF с минимальной шириной 75 мкм показала самый высокий процент отдельных ячеек и самый низкий процент кластеров / агрегатов. Планки погрешностей представляют собой стандартные ошибки по крайней мере из трех независимых экспериментов. * означает p <0,05 относительно контроля, не обработанного устройством (значение = 1).

Проверка производительности устройства с использованием ткани почек мыши

В качестве финального теста на диссоциацию мы оценили производительность оригинального многослойного и нового оптимизированного устройства с удлиненным акульим плавником с использованием ткани, полученной из недавно резецированных почек мыши. Почки сложно диссоциировать, потому что ткань содержит плотный массив кровеносных сосудов и канальцев, а эпителиальные клетки имеют плотные межклеточные соединения и специализированные базальные мембраны 19 , 36 .Свежие почки собирали у мышей, разрезали скальпелем на гистологически похожие срезы, взвешивали и затем измельчали ​​на ~ 1 мм 3 кусочков. Затем образцы обрабатывали коллагеназой в течение 15, 30 или 60 минут в конической пробирке при постоянном перемешивании и встряхивали каждые 5 минут. После разложения образцы обрабатывали с использованием трех различных условий устройства: 3 прохода через многослойное устройство, 10 проходов через многослойное устройство или 3 прохода через многослойные и однослойные устройства (расширенный плавник акулы, минимальная ширина 75 мкм), которые были подключены в ряд.Мы не тестировали однослойное устройство в одиночку из-за опасений о возможном засорении более узких каналов, а вместо этого использовали его только после многослойного устройства в качестве заключительного этапа полировки. Более того, мы использовали только 3 прохода при подключенном устройстве, потому что обработка образца была фактически удвоена, и, таким образом, мы могли максимизировать эффективность работы. Контрольные образцы механически обрабатывали встряхиванием и пипетированием после обработки коллагеназой в соответствии с обычной процедурой. Все расщепленные клеточные суспензии обрабатывали ДНКазой, фильтровали через клеточный фильтр с размером ячеек 40 мкм и разделяли на две типичные части.Одну часть обрабатывали буфером для лизиса эритроцитов и анализировали с использованием счетчика клеток, а другую часть зарезервировали для анализа проточной цитометрии. Для контроля восстановление клеток постепенно увеличивалось с ~ 1000 до 2000 клеток / мг ткани между 15 и 30 минутами переваривания, но подскочило до ~ 16000 клеток / мг через 60 минут (рис.). Во всех трех условиях устройства производилось значительно больше клеток, чем в контроле за каждый период переваривания. Через 15 мин после трех проходов через многослойное устройство было получено в 10 раз больше клеток, чем в контроле.Увеличение числа проходов устройства до 10 имело небольшой эффект, но совместная обработка с однослойным устройством дала на 30% больше ячеек. Результаты при времени переваривания 30 и 60 минут следовали аналогичным тенденциям, но с постепенно уменьшающимися различиями по сравнению с контролем, поскольку клетки лучше высвобождались ферментативно. Тем не менее, различия между условиями устройства также постепенно увеличивались. Что касается максимального выхода клеток, достигаемого после 60 мин переваривания, в условиях многослойного 3 прохода, многослойного 10 прохода и двойного устройства 3 прохода было получено на 50%, 100% и 200% больше клеток, чем в контроле, соответственно.Примечательно, что двойное устройство произвело больше клеток после короткого 15-минутного переваривания, чем контрольное после 60-минутного переваривания.

Анализ суспензий диссоциированных клеток почек мыши. Почки мышей измельчали, переваривали коллагеназой и обрабатывали в трех условиях устройства: исходное устройство ML на 3 и 10 проходов и комбинация устройств ML плюс SL (удлиненный плавник акулы, 75 мкм) на 3 прохода. ( a ) Число клеток определяли с использованием счетчика клеток после лизирования эритроцитов и показали, что во всех условиях устройства производилось значительно больше отдельных клеток, чем при расщеплении в одиночку (p <0.05 на все случаи). Устройства, связанные с ML и SL, обеспечивали наибольшее количество клеток за все время переваривания. Проточная цитометрия также использовалась для прямого анализа клеточных суспензий с целью идентификации тканевых клеток и оценки жизнеспособности. ( b ) Количество выделенных единичных тканевых клеток соответствовало результатам счетчика клеток, но с большей вариабельностью. ( c ) На жизнеспособность тканевых клеток не влияла обработка устройством через 15 и 60 минут. Наблюдалась незначительная тенденция к снижению жизнеспособности клеток через 30 минут, хотя это трудно интерпретировать с учетом данных за 15 и 60 минут.( d ) Относительное количество тканевых агрегатов по отношению к единичным тканевым клеткам увеличивалось со временем переваривания и было самым низким для состояния двойного устройства. Планки погрешностей представляют собой стандартные ошибки по крайней мере из трех независимых экспериментов. * Показывает p <0,05 относительно контроля при том же времени переваривания. # Указывает на p <0,05 по сравнению с состоянием ML 3 P.

Оставшаяся часть каждого образца была проанализирована проточной цитометрией с использованием панели флуоресцентных красителей, чтобы отличить тканевые клетки от неклеточного дебриса, эритроцитов и лейкоцитов, а также оценить жизнеспособность, как мы недавно описали 37 .Количество клеток ткани, полученных на 1 мг ткани, представлено на рис. 4 и в целом подтверждают результаты счетчика клеток, но с несколько большей вариабельностью. Неясно, была ли эта вариабельность связана с большим количеством этапов обработки и временем, необходимым для маркировки клеток с помощью зондов, более низкой надежностью проточной цитометрии для подсчета клеток или изменением внешнего вида клеток, которое повлияло на схему стробирования. Жизнеспособность тканевых клеток оставалась одинаковой для всех условий при времени переваривания 15 и 60 минут, хотя наблюдалась незначительная тенденция к снижению жизнеспособности клеток через 30 минут, что трудно интерпретировать с учетом данных за 15 и 60 минут (рис.). Восстановление эритроцитов и лейкоцитов следовало тем же тенденциям, что и тканевые клетки (см. Дополнительную информацию, рис. S6), предполагая, что как более длительное пищеварение, так и повышенная гидродинамическая диссоциация обеспечивали больший доступ к кровеносным сосудам и, вероятно, их разрушение. Интересно, что относительное количество тканевых агрегатов по отношению к единичным клеткам увеличивалось со временем переваривания в суспензиях контрольных клеток (рис.). Вероятно, это были кластеры и небольшие агрегаты, поскольку образцы фильтровали с помощью сетчатого фильтра 40 мкм.Совокупный процент был самым низким после использования устройства с однослойным удлиненным акульим плавником, поскольку они были преобразованы в большее количество отдельных клеток. Эти результаты убедительно демонстрируют, что гидродинамическая обработка с использованием нашей концепции устройства микрофлюидной диссоциации резко увеличивает восстановление клеток. Это наблюдалось как при коротком, так и при длительном времени переваривания, когда устройства последовательно высвобождали больше отдельных клеток. Более того, наша новая оптимизированная конструкция плавников акулы может производить больше отдельных ячеек за счет эффективного разрушения мелких агрегатов и скоплений.

Заключение

Здесь мы показываем, что однослойная полиимидная пленка может быть использована для изготовления надежных микрофлюидных устройств для разделения агрегатов и тканей раковых клеток на отдельные клетки. Мы также использовали этот метод как простой, недорогой и быстрый метод прототипирования для оптимизации характеристик канала. Хотя однослойный формат обычно менее эффективен, чем сопоставимая многослойная конструкция, уменьшение ширины канала и переход на новую геометрию расширения «акульи плавники» привели к наиболее эффективной диссоциации и максимальному восстановлению отдельных клеток, которые мы наблюдали на сегодняшний день.Мы также впервые продемонстрировали, используя ткань почек мыши, что наша концепция устройства микрожидкостной диссоциации может производить значительно больше отдельных клеток, чем только переваривание. Мы также показываем, что использование двух устройств может дать наилучшие результаты для тканей, поскольку в противном случае было бы трудно охватить достаточно большой диапазон размеров каналов, чтобы эффективно разрушить самые большие фрагменты ткани, чтобы устройство не забивалось, а также было способен преобразовывать самые маленькие кластеры ячеек в отдельные ячейки.В частности, комбинация многослойного устройства с большими размерами каналов и оптимизированного однослойного устройства с меньшими каналами акульего плавника позволила получить значительно больше отдельных клеток из тканей почек. Мы ожидаем, что эти результаты будут применены к другим типам тканей, таким как более мягкая и более хрупкая ткань печени или более жесткие и более плотные солидные опухоли, и тестирование этих образцов будет в центре внимания будущей работы. Это последнее устройство по-прежнему требует измельчения и разложения вне чипа, и поэтому основной целью будет интеграция с нашим устройством для микрожидкостного разложения 37 .Мы также продолжим изучать новые конструкции нашего устройства для диссоциации, а также комбинировать его с микрожидкостными устройствами, расположенными ниже по потоку, и проводить операции по обработке и анализу суспензий отдельных клеток.

Материалы и методы

Изготовление устройств

Устройства диссоциации были изготовлены с использованием полиимидных пленок, подвергнутых лазерной микрообработке, по методикам, аналогичным нашей предыдущей работе 28 . Вкратце, устройство состояло из 4 слоев, подвергнутых лазерной микрообработке, которые были ламинированы вместе следующим образом:

  1. Верхний слой был изготовлен из 1 слоя.Акриловые листы толщиной 5 мм (McMaster Carr, Elmhurst, IL) со сквозными отверстиями для доступа к микрожидкостным слоям.

  2. Второй слой был изготовлен из полиэтилентерефталатных пленок, на которых с обеих сторон нанесена клейкая лента для переноса на основе силикона (3M, St. Paul, MN). Второй слой содержал резервуар для сбора и подачи диссоциированных образцов к выпускному отверстию.

  3. Третий слой содержал структуры с разветвленными микрожидкостными каналами, которые были изготовлены путем лазерной микрообработки полиимидных пленок, обычно используемых в производстве гибких схем.

  4. Нижний слой был изготовлен из пленок ПЭТ с липкой лентой для переноса на силиконовой основе (3М, Сент-Пол, Миннесота) на верхней стороне. Этот слой изолирует слой микрофлюидного канала снизу.

Шланговые зазубрины были приклеены к верхнему слою готового устройства для обеспечения соединителей труб. Элементы 2D-канала были разработаны в AutoCAD (Autodesk, Сан-Рафаэль, Калифорния).

Моделирование динамики жидкости

Профили потока и скорости сдвига в жидкостных каналах были смоделированы с помощью программного обеспечения COMSOL Multiphysics (COMSOL, Burlington, MA).Моделирование методом конечных элементов проводилось путем объединения уравнений Навье-Стокса с уравнением неразрывности в предположениях ламинарного потока и граничного условия прилипания. Скорость потока составляла 1 или 12,5 мл / мин. Скорость потока оценивалась во всех областях расширения и сжатия для стадии 5 всех конструкций устройства. Скорость сдвига на центральной линии, где наиболее вероятно присутствие ячеек и агрегатов, также была рассчитана на основе градиентов потока в осевом и поперечном размерах.

Клеточные культуры и модели тканей

Клеточная линия рака молочной железы человека MCF7 была получена из ATCC (Манассас, Вирджиния) и культивирована в стандартных колбах для тканевых культур при 37 ° C в 5% CO 2 с использованием рекомендуемых сред: среды DMEM содержащий 10% FBS, 2 мМ L-глутамин, 1 мМ пируват натрия, 1 × заменимые аминокислоты, 100 Ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 44 Ед / л инсулина Novolin R (Thermo Fisher, Waltham, MA). Перед экспериментами конфлюэнтные монослои MCF7 переваривали трипсином-ЭДТА в течение 5 мин, что было достаточно для высвобождения клеток, но также для сохранения значительного количества клеточных агрегатов.Суспензии клеток промывали центрифугированием в PBS, содержащем 1% BSA (PBS +).

Почки были взяты у недавно умерщвленных мышей C57B / 6 или BALB / c (лаборатория Джексона, Бар-Харбор, штат Мэн), которые были сочтены отходами в результате исследования, одобренного Калифорнийским университетом, Ирвин, Комитетом по институциональному уходу и использованию животных (любезно предоставлено доктора Анджелы Г. Флейшман). С помощью скальпеля приготовили полоски ткани длиной ~ 1 см и диаметром ~ 1 мм, каждая из которых содержала гистологически похожие участки коры и продолговатого мозга.Затем каждую полоску ткани взвешивали для определения массы, измельчали ​​скальпелем до ~ 1 мм 3 штук и помещали в коническую пробирку с 200 мкл 0,25% коллагеназы типа I (Stemcell Technologies, Ванкувер, Британская Колумбия). Образцы переваривали при 37 ° C в инкубаторе при осторожном перемешивании с помощью вращающегося миксера в течение 15, 30 или 60 минут с последующим повторным встряхиванием и пипетированием для механического разрушения агрегатов. Затем клеточные суспензии обрабатывали 100 единицами ДНКазы I (Roche, Indianapolis, IN) в течение 5 минут при 37 ° C и промывали центрифугированием в PBS +.

Микрожидкостная диссоциация

Устройства были подготовлены путем прикрепления 3-дюймовой трубки из ПВХ 1 / 32ID (Nalgene, Рочестер, Нью-Йорк) к зазубринам шланга на входе и выходе. Трехходовой кран использовался для подсоединения устройства к шприцу, содержащему образец клеток, и буферному резервуару, содержащему 1 мл PBS +. Непосредственно перед экспериментами устройства заполняли блокирующим буфером SuperBlock (Thermo Fisher, Waltham, MA), инкубировали в течение 15 минут и промывали PBS +. Затем суспензии клеток загружали в шприц для образцов и вводили в устройство с помощью шприцевого насоса (Harvard Apparatus, Холлистон, Массачусетс) при скорости потока 12.5 мл / мин. Множественные проходы устройства были достигнуты путем реверсирования потока шприцевого насоса, чтобы вернуть образец обратно во входной шприц. Этот процесс повторялся для указанного количества проходов. Наконец, устройства промывали 1 мл PBS +, чтобы вымыть оставшиеся клетки.

Подсчет клеток и визуализация

Концентрацию клеток определяли с использованием счетчика клеток Moxi Z с кассетами типа S (Orflo, Hailey, ID), который использует принцип Коултера для подсчета клеток. Подсчет клеток выполняли непосредственно на суспензиях MCF7.Для образцов почек одну пятую каждой суспензии переносили в новую коническую пробирку и инкубировали с буфером для лизиса эритроцитов, содержащим хлорид аммония, карбонат калия и ЭДТА (BioLegend, Сан-Диего, Калифорния), в течение 5 минут при комнатной температуре до получения количество клеток. Суспензии клеток MCF7, оставшиеся после подсчета клеток, добавляли в 12-луночный планшет и отображали с использованием фазово-контрастного микроскопа Хоффмана с 4-кратным объективом. Необработанные изображения были преобразованы в двоичные с помощью MATLAB (MathWorks, Natick, MA), и все отдельные клеточные единицы были идентифицированы и очерчены с помощью ImageJ.Наконец, площадь каждого сотового блока была рассчитана и классифицирована по следующим категориям: отдельные ячейки (от 20 до 80 пикселей 2 или от 75 до 300 мкм 2 ), кластеры (от 80 до 200 пикселей 2 или от 300 до 750 пикселей). мкм 2 ), мелкие агрегаты (от 200 до 300 пикселей 2 или от 750 до 1120 мкм 2 ) и крупные агрегаты (> 300 пикселей 2 или> 1120 мкм 2 ). Сравнивая эти категории с микрофотографиями, кластеры коррелировали с ~ 2-3 ячейками, небольшие агрегаты содержали ~ 4-10 ячеек, а большие агрегаты включали> 10 ячеек.

Проточно-цитометрический анализ

Оставшиеся суспензии мышиных почечных клеток добавляли в пробирки для FACS (Corning, Corning, NY) и ресуспендировали в PBS +. Образцы сначала были помечены и проанализированы, как мы недавно описали 37 . Вкратце, клетки совместно окрашивали 0,5 × CellMask Green (Thermo Fisher, Waltham, MA) и 2,5 мкг / мл моноклонального антитела против CD45-PE мыши (клон 30-F11, BioLegend, Сан-Диего, Калифорния) при 37 ° С. ° C в течение 20 минут, дважды промывали PBS + центрифугированием и совместно окрашивали 12.5 мкМ DRAQ5 (BioLegend) и 5 ​​мкг / мл 7-AAD (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) на льду в течение не менее 15 минут перед анализом на проточном цитометре Accuri (BD Biosciences). Данные проточной цитометрии были компенсированы и проанализированы с использованием программного обеспечения FlowJo (FlowJo, Ashland, OR). Параметры компенсации были установлены с использованием измельченного контроля, который был переварен в течение 60 мин, CompBeads (диаметр 3,0–3,4 мкм, BD Biosciences) и препаратов с указанными выше красителями и без них или с подобранным изотипом, PE-конъюгированным моноклональным антителом (крысиный IgG2b клон RTK4530. , BioLegend), который использовался в качестве контроля.Ворота для каждой положительной и отрицательной субпопуляции были определены с помощью FlowJo для автоматического расчета матрицы компенсации. Наконец, была использована схема последовательного стробирования для идентификации живых и мертвых тканевых клеток из эритроцитов, лейкоцитов и неклеточного мусора (см. Дополнительную информацию, рис. S5).

Статистика

Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка, определенная как минимум в трех независимых экспериментах. P-значения были рассчитаны на основе средних значений и значений стандартной ошибки с использованием t-критерия Стьюдента.

Доступность данных

Все данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью (и ее файлы с дополнительной информацией).

Перейти к основному содержанию Поиск